日機裝株式會社、日本勃林格殷格翰株式會社與?澤?學(xué)醫(yī)藥保健研究域藥學(xué)系的?井 郁?教授等人的研究組，成功研發(fā)了具有正常培養(yǎng)條件下無法觀察到的腎臟功能的創(chuàng)新藥物研究用人腎細(xì)胞『3D-RPTEC』。新開發(fā)的技術(shù)有望在創(chuàng)藥研究領(lǐng)域中代替過去主要通過動物實驗測試藥物的細(xì)胞實驗，并且為提高新藥開發(fā)的效率做出貢獻。
本研究結(jié)果已在2023年6?29?科學(xué)志『 Drug Metabolism and Disposition 』 （https://dmd.aspetjournals.org/content/early/2023/06/29/dmd.122.001171）刊登。
創(chuàng)藥研究用人腎細(xì)胞，是通過用特殊的培養(yǎng)方法培養(yǎng)市售的人腎由來細(xì)胞，再現(xiàn)了至今為止難以觀察到的腎臟功能，實際已經(jīng)確認(rèn)其具備約20種主要藥物轉(zhuǎn)運體※ 的機能。
在創(chuàng)藥研究中，藥物的評價（藥物動態(tài)和毒性）主要是通過動物實驗進行的， 然而從物種差異和愛護動物的角度出發(fā)，通過細(xì)胞實驗代替動物實驗，在“試驗管內(nèi)（＝in vitro）”重現(xiàn)并進行評估是需求所向。由于評估是基于人類來源的腎細(xì)胞而非動物，除了能消除物種差異的問題，細(xì)胞實驗比動物實驗可以更快地從研發(fā)初期階段獲得數(shù)據(jù)，從而縮減藥物研發(fā)時間和成本。然而，一直以來都沒有能滿足創(chuàng)藥研究需求的人腎細(xì)胞。
與活體腎臟相比，傳統(tǒng)的人腎細(xì)胞（HK-2細(xì)胞和初代近端小管上皮細(xì)胞）在通常的培養(yǎng)條件下會喪失許多腎臟特有的機能(Jenkinson et al., Eur J Physiol, 2012) 。因此，在創(chuàng)藥研究時，很多情況下會通過動物實驗對腎臟進行評估。本次研究中，將在平面培養(yǎng)中無法顯現(xiàn)的人近端小管上皮細(xì)胞（RPTEC）的OAT1（有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1）的遺傳基因作為指標(biāo)，研究了培養(yǎng)條件，嘗試改善了RPTEC的腎臟機能。制造球狀細(xì)胞(以下簡稱3D-RPTEC) ，并在?定條件下經(jīng)三維培養(yǎng)后，OAT1遺傳基因顯現(xiàn)量隨培養(yǎng)天數(shù)上升，與人腎?質(zhì)的mRNA顯現(xiàn)量有相同程度的改善（圖1）。對本細(xì)胞實施微陣列的網(wǎng)羅性遺傳基因表達解析和蛋白質(zhì)組學(xué)的網(wǎng)羅性蛋白質(zhì)表達解析的結(jié)果表明，除OAT1外，監(jiān)管部門評估所需的SLC轉(zhuǎn)運體，比起平面培養(yǎng)，通過三維培養(yǎng)得到了改善，甚至在培養(yǎng)32天后仍能保持顯現(xiàn)（圖2）。
此外，在對來自三個不同供體的RPTEC進行三維培養(yǎng)的mRNA顯現(xiàn)分析中，約17000個基因中有87%的基因僅有50%的CV%變異，表明3D-RPTEC是一種供體差異小，易于使用的細(xì)胞。作為藥物評估的例子，實施了以細(xì)胞內(nèi)ATP量（生存率）為指標(biāo)的in vitro毒性試驗。結(jié)果表明，顯示藥物轉(zhuǎn)運體引起腎毒性的Cisplatin和Adefovir，濃度依賴性地使細(xì)胞內(nèi)ATP量減少。其減少分別被OCT（有機陽離子轉(zhuǎn)運體）的抑制劑Cimetidine、OAT（有機陰離子轉(zhuǎn)運體）的抑制劑Probenecid所抑制（圖3）。因此表明，3D-RPTEC在醫(yī)藥品開發(fā)中的藥物動態(tài)和毒性評估中，是一種簡便且高效的in vitro實驗系列。
概括而言，通過RPTEC制造球狀細(xì)胞，在一定條件下三維培養(yǎng)的具備腎臟主要功能之一的藥物轉(zhuǎn)運體與人腎臟的顯現(xiàn)量相同，并可長期維持28天以上（專利第6995112號）。另外，3D-RPTEC 還可用于觀察藥物轉(zhuǎn)運體引起的腎毒性。而且，不僅是藥物轉(zhuǎn)運體，蛋白質(zhì)組學(xué)檢測到的約4800種蛋白質(zhì)中有90%的顯現(xiàn)量與人腎臟中的顯現(xiàn)量水平相同，這表明3D-RPTEC在醫(yī)藥品開發(fā)中的藥物動態(tài)和毒性評估中，是一種簡便且高效的in vitro實驗系列。另外，不僅是創(chuàng)藥研究，這種人類腎臟細(xì)胞還有望用于各種與腎臟有關(guān)的研究中。
在3D-RPTEC中（左圖）OAT1遺傳基因的顯現(xiàn)量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，并在培養(yǎng)10天后達到最大值。
上述照片（右圖）由日機裝拍攝。
顯示常規(guī)平面培養(yǎng)中RPTEC的遺傳基因質(zhì)顯現(xiàn)量（A）和3D-RPTEC中的遺傳基因顯現(xiàn)量（B）。與常規(guī)平面培養(yǎng)相比，3D-RPTEC中藥物轉(zhuǎn)運體的顯現(xiàn)量得到了改善，并且能夠確定顯現(xiàn)量從培養(yǎng)的第12天一直維持到第32天。
顯示了在3D-RPTEC中暴露Cisplatin時細(xì)胞內(nèi)ATP量（A）與暴露Adefovir時細(xì)胞內(nèi)ATP量（B）。使用OCT及OAT的抑制劑，結(jié)果表明3D-RPTEC可檢測出藥物轉(zhuǎn)運體引起的毒性。
根據(jù)本研究成果，?機裝株式會社將創(chuàng)藥研究用人腎細(xì)胞『3D-RPTEC?』產(chǎn)品化，于2023年7月開始正式銷售。
今后，將3D-RPTEC作為腎臟評估的工具，在實驗現(xiàn)場廣泛應(yīng)用，努力實現(xiàn)利用人腎細(xì)胞進行細(xì)胞實驗的標(biāo)準(zhǔn)化。
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